2025年版《中國(guó)藥典》蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法及應(yīng)用
發(fā)布時(shí)間:2025-07-02 閱讀次數(shù)：69次
蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法及應(yīng)用指導(dǎo)原則簡(jiǎn)介
蛋白質(zhì)組(Proteome) 是一個(gè)細(xì)胞或組織中由基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics) 表示對(duì)整個(gè)蛋白質(zhì)組的研究，是一門大規(guī)模、高通量、系統(tǒng)化的研究某一類型細(xì)胞組織、某一基因組所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)，包括組成蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列，蛋白質(zhì)的豐度，蛋白質(zhì)的修飾以及蛋白質(zhì)之間的相互作用的學(xué)科。隨著人類基因組測(cè)序的完成，發(fā)現(xiàn)基因組學(xué)信息并不能完整地闡釋復(fù)雜疾病的發(fā)生與發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等蓬勃興起。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的最終執(zhí)行者，在生命及疾病發(fā)生發(fā)展過程中的意義重大，因此蛋白質(zhì)組學(xué)作為其中重要的研究領(lǐng)域之一受到關(guān)注。
1.1 適用范圍
本指導(dǎo)原則適用于蛋白質(zhì)組學(xué)在蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律、蛋白質(zhì)翻譯后修飾以及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用方面的分析研究，規(guī)范蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法的建立、分析過程的質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)分析，確保蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果的重復(fù)性與可靠性。
1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)的分析策略
1）自下而上（ Bottom up）- 肽水平蛋白質(zhì)組學(xué)
? 酶切：采用各種蛋白酶切為肽段
? 分離：各種分離技術(shù)對(duì)肽段混合物進(jìn)行分離
? 檢測(cè)：質(zhì)譜分析技術(shù)得到肽指紋圖譜
? 分析：蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)軟件分析得到蛋白的定性和相對(duì)定量結(jié)果
2）自上而下（ Top down）- 完整蛋白質(zhì)組學(xué)
? 直接對(duì)整個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析和鑒定
3）自中而下（ Middle down ）- 亞基水平蛋白質(zhì)組學(xué)
? 使用適宜的蛋白酶例如木瓜蛋白酶（Papain ）等將蛋白切為分子量約為 25-50 kDa 的亞基片段，進(jìn)行分離與分析
1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法
1）蛋白樣品的提取， 變性還原，酶解與多肽分離富集
? 凝膠電泳技術(shù)：二維凝膠電泳（ 2D PAGE ）、等電聚焦（ IEF ）技術(shù)等
? 色譜技術(shù)：反相色譜、離子交換色譜、分子排阻色譜、親和色譜和多維液相色譜等
2）蛋白質(zhì)分析與鑒定
? 質(zhì)譜技術(shù)（Bottom up、 Top down、Middle down ）：蛋白質(zhì)的分子量、序列、翻譯后修飾等相關(guān)信息
? 二維凝膠電泳技術(shù)：第一維電泳按照分子量分離，第二維將第一維按照分子量分離的蛋白依據(jù)等電點(diǎn)進(jìn)一步分離
? X射線技術(shù)：蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)
? 核磁共振技術(shù)：蛋白質(zhì)的二維或三維結(jié)構(gòu)信息，可以研究蛋白質(zhì)的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)和相互作用
? 透射電子顯微鏡技術(shù)：蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，解析大分子復(fù)合物、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和相互作用
3）數(shù)據(jù)分析搜庫(kù)工具
? 蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)：通常是FASTA格式，從公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載，如果是未知的蛋白，可以從DNA測(cè)序的序列翻譯成蛋白；最常用的數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot。
? 特異性酶解：在搜庫(kù)時(shí)要明確使用的蛋白酶，比如最常用的胰蛋白酶（軟件會(huì)自動(dòng)識(shí)別它在K或R后面切斷肽段）。如果我們不對(duì)酶切位點(diǎn)進(jìn)行限制，計(jì)算機(jī)只好把所有的可能都窮盡一遍，產(chǎn)生非常多可能的肽段，不僅運(yùn)行時(shí)間會(huì)非常長(zhǎng)，而且錯(cuò)誤匹配的可能性也會(huì)高很多。
? 轉(zhuǎn)錄后修飾：分兩類，一種叫固定修飾，即在某種氨基酸殘基上一定出現(xiàn)的特定基團(tuán)修飾，比如加入乙?；噭┻M(jìn)行乙酰化修飾；另一種叫可變修飾（動(dòng)態(tài)修飾），就是說某一種氨基酸殘基可能會(huì)被某種基因修飾（被修飾的可能性比較大），例如甲硫氨酸的氧化等。
? 碎片類型：CID或HCD碎裂產(chǎn)生by離子，搜索引擎就只按by離子的規(guī)則切割；沒特別的原因，不建議大家再加入其它離子類型，不然會(huì)大大延長(zhǎng)搜庫(kù)時(shí)間，還會(huì)引入錯(cuò)誤；如果是ETD碎裂則會(huì)產(chǎn)生cz離子，而QTOF會(huì)產(chǎn)生ax離子。搜庫(kù)軟件通常會(huì)根據(jù)我們指定的儀器類型來自動(dòng)判斷碎片離子的類型。
? 選擇合適的搜庫(kù)軟件：可使用MASCOT、PROTEIN METRICS、PEAKS Studio等。
1.4 蛋白質(zhì)組學(xué)分析的質(zhì)量控制
1）QC 樣品的類型
? 簡(jiǎn)單的肽混合物（ QC1）：?jiǎn)我坏鞍踪|(zhì)酶解產(chǎn)物，如牛血清白蛋白（BSA）
? 復(fù)雜的 QC 樣本（ QC2）：全細(xì)胞裂解物如酵母裂解物、 HeLa 細(xì)胞裂解物
? 合成的肽混合物（ QC3）：人工修飾或同位素標(biāo)記的方法合成肽混合物
2）QC 的評(píng)價(jià)指標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)
? 鑒定的多肽和蛋白質(zhì)，肽段譜匹配（ PSMs ）數(shù)量，二級(jí)譜圖的數(shù)量
? 肽段的平均豐度（基于母離子的離子信號(hào)強(qiáng)度）
? 所鑒定的肽段中 m/z 與理論值差距在 ±0.003 Da 內(nèi)的肽段的比例
? 最大進(jìn)樣時(shí)間內(nèi)所獲得的二級(jí)譜圖的比例
? 選定的示蹤肽段保留時(shí)間
表1 QC評(píng)價(jià)指標(biāo)
注：使用的檢測(cè)儀器不同，精密度有差異，可酌情調(diào)整。
3）QC 的數(shù)據(jù)處理
? 多肽的母離子和碎片信息搜索誤差：母離子10ppm、子離子0.02Da，或兩個(gè)均20ppm
? 多肽長(zhǎng)度（ Peptide Length）：通常在4~40 個(gè)氨基酸殘基，漏切最大位點(diǎn)數(shù)目為 2
? 錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（ False Discovery Rate FDR）：常見的 FDR 閾值是 1%（PSM、肽以及蛋白質(zhì)水平）
? 肽段譜圖匹配（ peptide spectrum matches PSM）：PSM 至少為 1
? 特征肽段（ Unique peptide）：定性的特征肽段檢測(cè)到的越多可信度越高，單個(gè)肽段進(jìn)行鑒定的蛋白需要額外進(jìn)行標(biāo)注
? 蛋白質(zhì)覆蓋率（ Protein Coverage）：70%及以上的覆蓋率
4）重復(fù)實(shí)驗(yàn)及其評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
? 生物學(xué)重復(fù)（必須進(jìn)行）：（主要用于評(píng)估不同生物樣本之間的一致性和重復(fù)性）至少3次，簡(jiǎn)單樣本5次，復(fù)雜樣本（人血液/組織）建議每組30個(gè)以上樣本10次重復(fù)
? 技術(shù)重復(fù)（尚無明確要求）：主要用于評(píng)估同一生物樣本在同一實(shí)驗(yàn)條件下的一致性和可重復(fù)性，樣品量足夠的情況下建議至少3次
評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
? 相關(guān)性分析：皮爾遜（Pearson） 相關(guān)系數(shù)-通常要求在 0.8 以上；
斯皮爾曼（ Spearman ）相關(guān)系數(shù)-通常要求在 0.7 以上
? 主成分分析（PCA ）：方差貢獻(xiàn)通常要求達(dá)到 70% 85% 或以上
? 重復(fù)檢測(cè)率或測(cè)量誤差分析：百分比變異系數(shù)（ coefficient of variation, CV）
通常要求小于 20%
1.5 蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用
? 未知蛋白質(zhì)鑒定、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析、靶向蛋白質(zhì)定量、以及生物技術(shù)藥物研發(fā)、質(zhì)量控制和體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究方面應(yīng)用越來越廣泛。
? 蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)目前通?；谫|(zhì)譜分析和生物信息學(xué)原理的高通量分析方法，快速、高效地檢測(cè)、鑒定和定量蛋白質(zhì)樣品中的成分、數(shù)量和相互作用等基本信息，進(jìn)而揭示蛋白質(zhì)在生命體內(nèi)的功能和調(diào)節(jié)等生物學(xué)特性。
? 重組蛋白類藥物分析中的應(yīng)用：分子量測(cè)定、氨基酸序列、肽譜、二硫鍵、翻譯后修飾（ N/O 糖基化位點(diǎn)、糖型）、雜質(zhì)（截短體、突變體、異構(gòu)體、聚集體、宿主細(xì)胞殘留蛋白）等的分析與鑒定。
蛋白質(zhì)組學(xué)分析解決方案
在蛋白質(zhì)組學(xué)和生物制藥領(lǐng)域，島津提供了一系列先進(jìn)的色譜、質(zhì)譜和光譜等分析技術(shù)，全面覆蓋蛋白質(zhì)鑒定、結(jié)構(gòu)解析、定量分析、藥物研發(fā)及質(zhì)控等關(guān)鍵需求。尤其在重組蛋白類藥物的研發(fā)和質(zhì)量控制中，島津的分析平臺(tái)能夠高效完成分子量測(cè)定、結(jié)構(gòu)表征、翻譯后修飾以及雜質(zhì)分析等關(guān)鍵任務(wù)，為生物制藥企業(yè)提供可靠的技術(shù)支持。
1 分子量測(cè)定/序列分析/翻譯后修飾分析(含二硫鍵和糖型分析)
2 分子量測(cè)定/翻譯后修飾分析
3 肽段含量測(cè)定/翻譯后修飾程度分析
蛋白質(zhì)組學(xué)分析應(yīng)用案例
1 自下而上（ Bottom up）- 肽水平蛋白質(zhì)組學(xué)
采用島津LCMS-9030 高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)英夫利昔單抗樣品進(jìn)行肽圖分析，并結(jié)合LabSolutions 和Protein Metrics（PMi 公司）軟件對(duì)肽圖分析結(jié)果進(jìn)行解析。結(jié)果顯示在只應(yīng)用胰蛋白酶的情況下，輕鏈和重鏈的序列覆蓋率分別為93.46% 和92.00%。經(jīng)Protein metrics 軟件對(duì)肽段上的修飾基團(tuán)進(jìn)行解析，結(jié)果顯示該單抗樣品上的修飾類型有脫酰胺（deamidated）、糖基化（NGlycan）、氧化（Oxidation）、氨甲?；–arbamyl） 等，大部分修飾類型所占比例在0.5% 以下（圖 1）。
圖1 英夫利昔單抗酶解后肽圖蛋白分析
2 自上而下（ Top down）- 完整蛋白質(zhì)組學(xué)
采用島津LCMS-9030 高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)重組人源化單抗IgG1κ NISTmAb 進(jìn)行整體蛋白分析（圖 2），并結(jié)合島津LabSolutions 和Protein Metrics（PMi 公司）軟件對(duì)多電荷分析結(jié)果進(jìn)行解卷積和修飾基團(tuán)確認(rèn)（圖 3）。結(jié)果顯示該重組人單抗含有不同的糖基修飾，包含G2F/G2F，G1F/G2F，G1F/G1F，G0F/G0F， G0F/G1F，和理論值的偏差均小于3Da（表 2）。
表2 軟件自動(dòng)識(shí)別的不同修飾的NIST mAb結(jié)構(gòu)
3 自下而上（ Bottom up）- 多肽藥物結(jié)構(gòu)表征
采用島津LCMS-9050高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)替爾泊肽酶切后樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集（圖 4），并結(jié)合PEAKS軟件對(duì)采集結(jié)果解析，對(duì)替爾泊肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確認(rèn)（圖5）。結(jié)果顯示，使用Lys-C酶切能夠?qū)崿F(xiàn)100%的序列覆蓋度，并且推測(cè)出序列中氨基酸的修飾位點(diǎn)（圖 6）。該結(jié)果可為多肽藥物的結(jié)構(gòu)確證提供方法參考。
圖6 替爾泊肽序列覆蓋結(jié)果
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